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對蝦急性肝胰腺壞死病PCR檢測方法免費公開
2018/4/26 15:11:56

   以泰國T.W.Flegel教授以及臺灣羅竹芳教授為首的研究人員已經公開確定引起急性肝胰腺壞死?。╤epatopancreatic necrosis disease,AHPND)的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測的方法,并且公布了檢測方法的PCR引物以及反應方法。

  

  前言:

  

  在泰國,實驗由Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學杰出人才中心對蝦研究組)、瑪希隆大學公共衛生部和水產養殖企業研究中心部、水產科學研究院、農業大學等多名研究人員完成的。自2011以來,這項工作得到了農業研究發展機構、臺灣國家科學委員會等多個機構的資金支持。

  

  2013年12月5日,研究人員通過獲得的基因序列的對比信息,參照對比信息可以測試不同的PCR檢測方法,他們花了近20天的時間來驗證不同的PCR檢測,并公布了他們認為最好的檢測方式。

PCR  操作:

  預熱 : 94°C, 5min

  PCR 25~30 cycles with:

  變性 : 94°C, 30 sec

  退火 : 60°C, 30 sec 

  延伸 : 72°C, 60 sec 

  后延伸 : 72°C, 10 min

  擴增產物  : ~700 bp

  

  AHPND 引物組1 (AP1) 

  AP1F:- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’  

  AP1R:- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’ 

  AP1擴增產物為700 bp

  

  AHPND 引物組2 (AP2)  

  AP2F:- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’ 

  AP2R:- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’

  AP2擴增產物為700 bp



正文如下:

  

  目前,養蝦業在亞洲的經濟局勢非常嚴峻,由對蝦死亡和停止養蝦造成的經濟損失非常大。我們相信及時公布檢測方法,降低AHPND暴發風險的所獲得的收益,遠遠比從檢測產品中收到的專利費用以及我們研究所需要的費用要多。如果要申請專利,還需要推遲幾周甚至到幾個月的時間用來準備文件,以及準備足量的商業檢測試劑盒投入市場,以滿足市場需求。我們無法預測推遲幾天、幾周甚至幾個月里,將造成的潛在市場經濟損失。

  

  基于以上諸多因素,我們決定公開AHPND的PCR檢測操作方法,允許這些信息更為廣泛、迅速的傳播,以減少暴發AHPND的風險。

  

  雖然我們已經做了大量測試,但由于樣本數還是有限的,簡單地說,我們發現以下幾個情況:

  

  1、這兩對引物檢測了68個樣品,兩對引物檢測67個樣本的檢測結果是一致的。

  

  2、從糧農組織在越南用于研究宏基因組學分析收集的對蝦肝胰臟組織(每個池塘10蝦)的14個樣本中,其中8個樣品具有積極的AHPND病理特征,但PCR檢測結果顯示5個為陽性結果3個為陰性結果(兩對引物檢測顯示結果);而5個樣品的AHPND病理特征不明顯的,兩對引物PCR檢測結果均為陰性結果。

  

  3、68個測試樣本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND樣本中,并通過生物鑒定都可以導致AHPND病變,其中有3個樣品是在2002年在對蝦底泥中分離得到的弧菌,并被證實并不會引起暴發AHPND(兩對引物檢測結果顯示呈陰性),另外2株在水體及蝦體取得的樣本,尚未進行生物測試。

  

  4、有一個弧菌生物測定不會導致AHPND的組織病理,但是養殖過程中的卻造成高死亡率并伴隨著肝胰腺組織病變癥狀,兩對引物PCR檢測結果均為陽性。

  

  5、新分離的瓦氏菌(Shewanella)、紅球菌(Rhodococcus)、賴氏細菌(Leifsonia)、戴爾福特菌( Delftia)、青枯菌(Ralstonia)、創傷弧菌(V. vulnificus)、哈維氏弧菌( V. harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的兩對引物檢測結果為陰性。

  

  至此,我們不能保證所闡述的方法與每個可能的非AHPND細菌的樣本或者其它有機體沒有交叉反應。我們也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。我們也邀請所有行業人員,幫助我們進行進一步的驗證、改進這個檢測方法。

  

  我們初步的序列拼接和序列比較分析表明,我們已經確定了的目標序列來自細菌的質粒DNA并不是來自于AHPND菌株的染色體DNA。如果這個假設被證實,這也將影響AHPND有關的毒力傳導機制。然而確定毒素所需的時間目前還無法確定。由于情況緊急,我們決定發布PCR檢測引物序列信息,它將作為一個臨時檢測工具,直到毒素被確定。


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